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2×pEC-T vector Fast Ligation Mix(規(guī)格:20次×5 | 貨號:HKT006-01B)

英文名稱:2×pEC-T vector Fast Ligation Mix

貨 號 :HKT006-01B

規(guī) 格 :20次×5

用途:T載體

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產(chǎn)品名稱:2×pEC-T vector Fast Ligation Mix

產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格:

編號產(chǎn)品名稱規(guī)格產(chǎn)品介紹價格
HKT006-01B2×pEC-T vector Fast Ligation Mix20次×5T載體2398

產(chǎn)品描述:
      Easy Cloning T-vector 是一種PCR產(chǎn)物高效TA克隆的專用T載體。它由pBluescript II KS 載體改造而成:保留了pBluescript II KS 載體全部的酶切位點;PCR 產(chǎn)物插入位點處于多克隆酶切位點的中間,其兩側(cè)都有眾多的酶切位點可供選擇。
      傳統(tǒng) T 載體在進(jìn)行連接時的操作程序是:載體、片段、T4 DNA Ligase Buffer、T4 DNA Ligase。本制品是在傳統(tǒng)模式上將除了插入片段的各成分進(jìn)行預(yù)混,并使其在穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)化子數(shù)目、陽性率方面不低于傳統(tǒng)模式,使用時只需加入插入片段即可,大大簡化了操作過程,降低了配制連接體系過程中的誤差和污染率,節(jié)省了時間。

產(chǎn)品特點:
      高效:快速連接,15 分鐘即可完成連接反應(yīng)。
      穩(wěn)定:-20℃取出反復(fù)凍融 20 次,克隆數(shù)目及陽性率不受影響。
      快捷:只需加入插入片段再補充去熱源水到 10μL 體系。

使用建議:
      1)連接使用的 PCR 片段 3'端應(yīng)帶有 A 末端,如果是使 用 pfu 等高保真聚合酶擴增的不帶 A 末端的平末端片段, 不可直接用于進(jìn)行連接反應(yīng)。
      2)克隆時使用的 Insert DNA 片段(PCR 產(chǎn)物)建議進(jìn)行切膠回收純化,否則 PCR 產(chǎn)物中的短片段 DNA、殘留引物等雜質(zhì)都會影響 TA 克隆效率。
      3)轉(zhuǎn)化過程中建議使用Control Insert DNA做對照,以便在實驗出現(xiàn)問題時確定原因。

保存溫度:-20℃

2×pED-T vector Fast Ligation Mix 產(chǎn)品包裝(A包裝):

2×pSC-T vector Fast Ligation Mix 產(chǎn)品包裝(A包裝)

質(zhì)量保證:
   Control Insert 克隆后的白色菌落中,有 90% 以上含有 Insert DNA 片段。 
   Control Insert 經(jīng)克隆后,經(jīng)測序確認(rèn)''T''突出的存在。

操作方法:

1) 快速連接反應(yīng)體系:

組分體積
2×pEC-T vector Fast Ligation Mix (10 ng/μL)10μL
目的PCR 片段/ Control Insert DNAX μL/1μL
ddH2O至 20μL

反應(yīng)條件:16℃或 25℃下,保溫15至30分鐘。
      注:保溫5分鐘也能正常進(jìn)行連接反應(yīng),但反應(yīng)效率略為降低。25℃下進(jìn)行連接,其效果略差于16℃下連接效果。而更高的溫度(>26℃)則較難形成環(huán)狀DNA。

2) 取10μL加入至100μL感受態(tài)細(xì)胞中,用移液槍吹打混合,冰上放置30分鐘。 
3) 將離心管置于42℃水浴中,熱激60-90秒,迅速將離心管置于冰上,放置2-3分鐘。 
4) 向每個離心管中加入500μL無菌不含抗生素的LB或SOC培養(yǎng)基中,37℃搖床,150rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘,使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá),菌體復(fù)蘇。
5)吸取 200μL 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,加到含氨芐青霉素的 LB 或SOC 固體平板上,用無菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開,將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收,倒置培養(yǎng) 12-16 小時。 
6) PCR 檢測,利用試劑盒自帶高速 PCR 擴增試劑 2×FastTaq Mast Mix 直接進(jìn)行菌落PCR 鑒定。

pEC-T 結(jié)構(gòu)圖

f1 (+) origin135–441
LacZ alpha fragment451–832
multiple cloning site653–776
pUC origin1174–1841
Amp resistance gene1992-2849

pSC-T結(jié)構(gòu)圖

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