產(chǎn)品名稱：pTrx-TEV Expression Kit
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價格 |
| HKV102-01A | pTrx-TEV Expression Kit | 1μg/20次 | 表達載體 | 960 |
產(chǎn)品描述：
本質(zhì)粒以 Nco I 線性化方式提供，請配合 Plus PCR 一步定向 克隆試劑盒（Cat. No：HKNR005）使用。Trx 是實驗室中 最常 用的融合標簽之一，能夠促進目標蛋白質(zhì)的溶解性和正確折 疊。在需要用 TEV 蛋白酶（Cat. No: HKPE004）切割的時候， 經(jīng)常會產(chǎn)生非特異性切割，產(chǎn)生兩個標簽帶。pTrx 通過刪除部 分氨基酸序列，在保留原有 Trx 融合蛋白質(zhì)優(yōu)勢的同時，避免了 非特異性酶切，使酶切結(jié)果的判斷和目標蛋白質(zhì)的分離變的更加 方便。
目的基因擴增按常規(guī)方法設(shè)計引物后，在上游引物 5′端引 物前添加以下序列：CTC TAC TTC CAA GGT；下游引物 5′端引 物前添加：TTC GGA TCC GAT ATC。不希望目標蛋白C 端保留 His Tag 時，3′端引物需要加入終止密碼子。
產(chǎn)品特點：
改造后的 Trx 融合標簽?zāi)軌虼龠M目標蛋白質(zhì)的溶解性和正確 折疊。
特異性切割，便于酶切結(jié)果的判斷和目標蛋白質(zhì)的分離。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便, 一步完 成質(zhì)粒構(gòu) 建。
保存溫度：-20℃
pTrx-TEV Expression Kit 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pTrx-TEV（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| TEV Protease（10U/μl） | 10μl |
質(zhì)量保證：pTrx-TEV 線性化載體經(jīng)過嚴格的自連測 試 以及連接效率測試，滿足下游實驗需求。
注意事項：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物 二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3）引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計要保證目的片段兩 端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR 擴增 的保真度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA 聚合 酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 35- 40bp，包括 5'端 與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20-25bp 序列。
（注意：如果是表達載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計完成后，請注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細胞效率要大于 5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細胞，輕彈管壁使細胞重懸 起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細胞中，用移液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速 將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的 LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達，菌體復(fù)蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，加到含氨芐青 霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細 胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完 全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進行菌落 PCR 鑒 定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們建議 一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的 片段 特異性引物。
pNovoTrx-TEV 結(jié)構(gòu)圖：
| T7 promoter | 686 -702 |
| lac O | 659-683 |
| Trx Tag | 123 -614 |
| Enterokinase site | 219-233 |
| T7 Terminator | 26 -72 |
| F1 origin | 5356- 5811 |
| Amp resistance | 4367- 5224 |
| ColE1 Ori | 3546 -4219 |
| lac I CDS | 1093 - 2172 |
