產(chǎn)品名稱:蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
英文名稱:Rapid Detection Kit for Bacilluscereus (Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格:
編號 | 規(guī)格 |
---|---|
FZ023BF2 | 48 測試/盒 |
產(chǎn)品簡介:本試劑盒僅適用于食品中蠟樣芽孢桿菌的定性檢測。
檢測原理:基于 Real Time PCR 技術,利用針對于蠟樣芽孢桿菌 16s rRNA、gyrB 基因設計特異性引物、熒光探針以及其他反應所需試劑,加入待檢樣品即可進行擴增反應。在發(fā)生擴增過程中,熒光探針與目的基因片段結(jié)合,可被 Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號,此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號,同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應的實時擴增曲線,進而判定蠟樣芽孢桿菌是否檢出。
16s rRNA、gyrB 基因分別對應熒光報告基團 VIC、FAM。
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)產(chǎn)品組分:
儲存條件與保質(zhì)期:-20℃避光儲存,有效期為 12 個月,避免反復凍融。
靈敏度:最低檢驗限達到 100 CFU/Test。
所需其他材料和適用儀器:熒光定量 PCR 儀(具有能夠檢測 VIC、FAM 標記的熒光通道)、高速離心機、移液器、移液槍頭及離心管等。
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南:
1,樣品前處理:
1) 樣品增菌液模板 DNA 的制備:
a) 參照 GB《4789.14-2014 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》處理食品樣品,使用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯進行增菌,增菌時間不低于 24 h。
b) 取以上增菌液 1 mL 到 1.5 mL 規(guī)格的無菌離心管中,6000 r/min 離心 5 min,完全去除上清;
c) 加入 30 μL 裂解液充分懸浮管底沉淀,輕彈管壁消除氣泡,99℃加熱 10 min。
d) 12000 r/min 離心 15 min,上清即為待測樣品 DNA,靜置冰上,長時間不用應再次離心。
2) 可疑菌落模板 DNA 的制備:挑取 MYP 瓊脂平板上可疑菌落,充分懸浮于預先加有 30 μL 裂解液的無菌離心管中,后按照上述步驟 c)、d)操作。
以上 2 個 DNA 純化使用商品化的試劑盒提取 DNA 效果更佳。
2, 加樣、反應
1) 按照需求取 n 個 PCR 反應管(n=1 管陰性對照+待檢測樣品數(shù)+1 管陽性對照),從試劑盒中取出預混液,充分融化,渦旋后短暫離心,以上每管加入20 μL預混液,待用。
2) 向上述 n 個反應管中分別加入陰性對照、待測樣品 DNA、陽性對照各 5 μL,總反應體積為 25 μL。蓋緊管蓋,短暫離心,立即進行 PCR 擴增反應。
3) PCR 反應體系為 25 μL,取 VIC、FAM 檢測通道,在反應階段 2 中 60℃時收集熒光信號,具體程序如下:
反應階段 | 溫度 | 時間 | 信號收集 | 循環(huán)數(shù) |
1 | 95°C | 30 sec | 1 | |
2 | 95°C | 5 sec | } 40 | |
60°C | 40 sec | ? |
注:在反應階段 2 中 60℃時收集熒光信號,對于多通道熒光 PCR 儀,取熒光素“VIC”、“FAM”為信號采集通道,淬滅基團選擇“None”,染料校正選擇“None”。
3, 結(jié)果:一般情況下,可通過軟件自動設定的基線、閾值等直接讀取檢測結(jié)果。如需調(diào)整,可根據(jù)所使用儀器的自身情況(如噪聲等)以及選取的不同熒光通道進行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制:陰性對照未出現(xiàn)明顯的 S 型擴增曲線或Ct 值>35,陽性對照出現(xiàn) S 型擴增曲線且其 Ct 值<30。若陰陽性對照不同時滿足上述條件,則本次檢測結(jié)果無效,應重新檢測或與產(chǎn)品技術支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀:(根據(jù)反應所得 Ct 值判讀,具體見下表:)
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)使用注意事項:
1、實驗環(huán)境條件和過程控制應參照 GB/T 27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》規(guī)定執(zhí)行。
2、使用本試劑盒前請仔細閱讀本說明書全文,檢測過程中建議穿潔凈工作服,戴一次性手套,使用的移液槍頭需提前滅菌。
3、試劑盒中試劑使用前需充分融化、混勻,短暫離心后使用,期間需盡量避免產(chǎn)生氣泡,加樣完畢后檢查反應管是否蓋緊,避免泄露造成污染。
4、待檢測樣品基因變異可能會造成假陰性結(jié)果;待檢測樣品交叉污染、實驗室環(huán)境污染以及試劑污染均會造成假陽性結(jié)果。
5、不同批號的產(chǎn)品請勿混合使用,請在產(chǎn)品有效期內(nèi)使用試劑盒,由于操作不當引起的誤判,以及由此誤判引發(fā)的其他事項,本公司概不負責。
6、檢測完畢后,根據(jù)相關規(guī)定正確處理廢棄耗材以及擴增產(chǎn)物。