產品名稱：蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
英文名稱：Rapid Detection Kit for Bacilluscereus (Fluorescent Probe Assays)
產品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 規(guī)格 |
|---|---|
| FZ023BF2 | 48 測試/盒 |
產品簡介：本試劑盒僅適用于食品中蠟樣芽孢桿菌的定性檢測。
檢測原理：基于 Real Time PCR 技術，利用針對于蠟樣芽孢桿菌 16s rRNA、gyrB 基因設計特異性引物、熒光探針以及其他反應所需試劑，加入待檢樣品即可進行擴增反應。在發(fā)生擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結合，可被 Taq酶分解并產生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據其強弱變化繪制出相應的實時擴增曲線，進而判定蠟樣芽孢桿菌是否檢出。
16s rRNA、gyrB 基因分別對應熒光報告基團 VIC、FAM。
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）產品組分：
儲存條件與保質期：-20℃避光儲存，有效期為 12 個月，避免反復凍融。
靈敏度：最低檢驗限達到 100 CFU/Test。
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測 VIC、FAM 標記的熒光通道）、高速離心機、移液器、移液槍頭及離心管等。
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用指南：
1，樣品前處理：
1) 樣品增菌液模板 DNA 的制備：
a) 參照 GB《4789.14-2014 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》處理食品樣品，使用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯進行增菌，增菌時間不低于 24 h。
b) 取以上增菌液 1 mL 到 1.5 mL 規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min 離心 5 min，完全去除上清；
c) 加入 30 μL 裂解液充分懸浮管底沉淀，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min。
d) 12000 r/min 離心 15 min，上清即為待測樣品 DNA，靜置冰上，長時間不用應再次離心。
2) 可疑菌落模板 DNA 的制備：挑取 MYP 瓊脂平板上可疑菌落，充分懸浮于預先加有 30 μL 裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟 c)、d)操作。
以上 2 個 DNA 純化使用商品化的試劑盒提取 DNA 效果更佳。
2, 加樣、反應
1) 按照需求取 n 個 PCR 反應管（n=1 管陰性對照+待檢測樣品數+1 管陽性對照），從試劑盒中取出預混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入20 μL預混液，待用。
2) 向上述 n 個反應管中分別加入陰性對照、待測樣品 DNA、陽性對照各 5 μL，總反應體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進行 PCR 擴增反應。
3) PCR 反應體系為 25 μL，取 VIC、FAM 檢測通道，在反應階段 2 中 60℃時收集熒光信號，具體程序如下：
| 反應階段 | 溫度 | 時間 | 信號收集 | 循環(huán)數 |
| 1 | 95°C | 30 sec | 1 | |
| 2 | 95°C | 5 sec | } 40 | |
| 60°C | 40 sec | ? |
注：在反應階段 2 中 60℃時收集熒光信號，對于多通道熒光 PCR 儀，取熒光素“VIC”、“FAM”為信號采集通道，淬滅基團選擇“None”，染料校正選擇“None”。
3, 結果：一般情況下，可通過軟件自動設定的基線、閾值等直接讀取檢測結果。如需調整，可根據所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進行調整。
1) 質量控制：陰性對照未出現明顯的 S 型擴增曲線或Ct 值＞35，陽性對照出現 S 型擴增曲線且其 Ct 值＜30。若陰陽性對照不同時滿足上述條件，則本次檢測結果無效，應重新檢測或與產品技術支持聯系。
2) 結果判讀：（根據反應所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用注意事項：
1、實驗環(huán)境條件和過程控制應參照 GB/T 27403《實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》規(guī)定執(zhí)行。
2、使用本試劑盒前請仔細閱讀本說明書全文，檢測過程中建議穿潔凈工作服，戴一次性手套，使用的移液槍頭需提前滅菌。
3、試劑盒中試劑使用前需充分融化、混勻，短暫離心后使用，期間需盡量避免產生氣泡，加樣完畢后檢查反應管是否蓋緊，避免泄露造成污染。
4、待檢測樣品基因變異可能會造成假陰性結果；待檢測樣品交叉污染、實驗室環(huán)境污染以及試劑污染均會造成假陽性結果。
5、不同批號的產品請勿混合使用，請在產品有效期內使用試劑盒，由于操作不當引起的誤判，以及由此誤判引發(fā)的其他事項，本公司概不負責。
6、檢測完畢后，根據相關規(guī)定正確處理廢棄耗材以及擴增產物。
