一、菌落總數(shù)定義和衛(wèi)生學(xué)意義

?菌落總數(shù)定義：指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）檢樣所生長(zhǎng)出來(lái)的菌落數(shù)

?衛(wèi)生學(xué)意義：菌落總數(shù)測(cè)定是用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

二、新標(biāo)準(zhǔn)概況

2022年06月30日發(fā)布     2022年12月30日實(shí)施

本標(biāo)準(zhǔn)與ＧＢ４７８９.２—２０１６相比，主要變化如下： —— 增加了附錄Ｂ(菌落總數(shù)結(jié)果不同情況計(jì)算方法示例)； —— 修改了設(shè)備和材料； —— 修改了培養(yǎng)基和試劑； —— 修改了檢驗(yàn)程序； —— 修改了操作步驟； —— 修改了附錄 Ａ（pca配方標(biāo)注主要營(yíng)養(yǎng)成分）。

三、修訂亮點(diǎn)

修訂亮點(diǎn):“增加菌落總數(shù)測(cè)試片”

四、HandyPlate測(cè)試片的質(zhì)量控制

HandyPlate測(cè)試片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

?GB4789.28-2013 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

測(cè)試片使用步驟：
1、制備適宜濃度的測(cè)試菌液(可按GB4789.28自己制備，也可采用商品的定量菌株）

2、取1ml接種待測(cè)試測(cè)試菌片，另取1ml測(cè)試菌液傾注參比培養(yǎng)基TSA，按GB4789.28-2013附錄D中平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上的培養(yǎng)條件進(jìn)行。

3、計(jì)數(shù)待測(cè)測(cè)試片上和參比培養(yǎng)基TSA上的菌落數(shù)（下圖為測(cè)試菌大腸埃希氏菌ATCC25922在菌落總數(shù)測(cè)試片和參比培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)果）

選擇菌落數(shù)適中的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，按下列式（1）計(jì)算生長(zhǎng)率。

式中：
PR——生長(zhǎng)率；
NS——待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)；
N0——參比培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)。
參比培養(yǎng)基的選擇：一般細(xì)菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂，對(duì)營(yíng)養(yǎng)有特殊要求的微生物采用適合其生長(zhǎng)的不含抑菌劑或抗生素的培養(yǎng)基。
5、結(jié)果判定

依據(jù)GB4789.28-2013附錄D中平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)各測(cè)試菌的生長(zhǎng)率≥0.7，如測(cè)試的測(cè)試片各測(cè)試菌生長(zhǎng)率≥0.7，則報(bào)告檢驗(yàn)合格，否則，為不合格。

五、其他變更情況

其他一般修訂內(nèi)容：

六、操作流程及注意事項(xiàng)

菌落總數(shù)檢驗(yàn)流程圖

操作注意事項(xiàng)
1：從樣品的均質(zhì)到傾注瓊脂，應(yīng)在盡快完成，避免影響結(jié)果；
2：檢驗(yàn)所用物品需無(wú)菌和無(wú)殘留的抑菌物質(zhì)；
3：建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因?yàn)榱姿猁}緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化，對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用；
4：高壓滅菌后，培養(yǎng)基的瓊脂會(huì)分層在底部，應(yīng)搖勻后使用；
5：在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，為防止中間平皿過(guò)熱，高度不得超過(guò)6個(gè)平皿。測(cè)試片堆疊不超20片

七、結(jié)果計(jì)算

1. 結(jié)果計(jì)數(shù)

?可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。 

?選取菌落數(shù)在30CFU~300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。

?其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。

?當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)勢(shì)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

2. 結(jié)果計(jì)算

?若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在30~300CFU之間,計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果，示例B1。

?若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),其他平板可記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算，示例B3。

?若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算，示例B4。

?若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算，示例B5。

?若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 時(shí),則以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算，示例B6。

?若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按式(1)計(jì)算，示例B2

表1  菌落總數(shù)結(jié)果計(jì)算與報(bào)告方式實(shí)例

3. 結(jié)果報(bào)告

?菌落數(shù)小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告。

?菌落數(shù)大于或等于100CFU 時(shí),第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。 

?若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落蔓延。（已刪除）

?若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

?稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報(bào)告,體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。

八、質(zhì)量控制和疑難解析

1. 樣品處理時(shí)是否需調(diào)節(jié)pH?

 答：菌落總數(shù)大部分細(xì)菌都是嗜中性的，在偏酸偏堿的環(huán)境中都不適宜生長(zhǎng)，如果樣品本身偏酸或偏堿，那接種后會(huì)改變平板瓊脂培養(yǎng)基的pH，從而影響樣品中大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2. 菌落蔓延怎么辦？

 答：首先需分析菌落蔓延的原因，一可能是樣品中含有運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的細(xì)菌如：變形桿菌、芽孢桿菌等，二可能是傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度高，形成較多冷凝水，三可能是培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有倒置，冷凝水滴落所致。

解決辦法：一、注意傾注培養(yǎng)基溫度控制在40-45度之間，避免冷凝水形成；二、培養(yǎng)時(shí)需倒置；三覆蓋一層培養(yǎng)基；四在培養(yǎng)基中添加ttc0.5%，三 、使用菌落總數(shù)測(cè)試片。

3. 菌落總數(shù)計(jì)數(shù)同一個(gè)稀釋度一個(gè)在計(jì)數(shù)范圍，一個(gè)不在計(jì)數(shù)范圍，怎么計(jì)？

 答：以在計(jì)數(shù)范圍的平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為報(bào)告結(jié)果。例如：某樣品10-1平板菌落數(shù)分別320、288，10-2稀釋度平板菌落數(shù)26、20，則樣品檢測(cè)結(jié)果選取288進(jìn)行報(bào)告，結(jié)果報(bào)告為2.9×10的3次方。

4. 平行兩個(gè)板結(jié)果相差較大？

 答：可能是樣液未完全混勻，導(dǎo)致菌落分布不均勻；或者取樣偏差較大，注意校準(zhǔn)取樣器具和取樣操作細(xì)節(jié)。平板間、稀釋度間菌落數(shù)誤差率不宜超10%。

5. 低稀釋度平板菌落數(shù)少于高稀釋度平板菌落數(shù)的原因是？

 答：一產(chǎn)品中含防腐劑或抑菌成分，二產(chǎn)品偏酸或偏堿。

6. 做菌落總數(shù)檢測(cè)時(shí)，沒(méi)有菌落是怎么回事？

 答：一可能是樣品經(jīng)過(guò)滅菌處理，本身就沒(méi)有菌；二是檢測(cè)選擇的稀釋度過(guò)高；三樣品含抑菌成分未做去干擾處理；四傾注培養(yǎng)基溫度高或者培養(yǎng)條件不適宜等等。

7. 菌落總數(shù)的單位CFU與個(gè)有什么區(qū)別？

 答：CFU是菌落形成單位，單不等于細(xì)菌個(gè)數(shù)，如兩個(gè)相同的細(xì)菌細(xì)胞連在一起，那經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后這兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞將會(huì)形成一個(gè)菌落。

8. 如何保證檢測(cè)結(jié)果的有效性？

 答：一檢測(cè)過(guò)程需做空白對(duì)照，避免外源污染物影響；二檢驗(yàn)用培養(yǎng)基使用前需進(jìn)行質(zhì)量確認(rèn)；三檢驗(yàn)過(guò)程所用器具經(jīng)檢定，操作規(guī)范減少誤差。

Q-Strain定量質(zhì)控菌株

九、所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

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