小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的生物學特性

生物學特性：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌革蘭氏染色陰性，菌體呈球桿狀，不形成芽孢，22℃~30℃培養(yǎng)時周身可形成豐富鞭毛，需氧厭氧條件均可生長，生長范圍溫度0℃~45℃，最佳生長溫度為26℃。

流行學特征：是一種人獸共患病原菌，廣泛分布于自然界中，在海產(chǎn)品、蛋類、鮮奶、飲料、速凍食品中可分離到該菌，是冰箱中存放食物的重要污染菌，被稱為“冰箱菌”；主要通過人畜接觸和糞口途徑傳播，感染后主要癥狀為腹瀉、腸炎等，還能引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼、結(jié)締組織和其他一些全身性疾病癥狀。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢驗

增菌
? 以無菌操作取25g(或25mL)樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩沖液增菌液的無菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋內(nèi)，以8000r/min均質(zhì)1min或拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min。
? 液體樣品或粉末狀樣品，應(yīng)振蕩混勻。均質(zhì)后于26℃1℃增菌48h~72h。增菌時間長短可根據(jù)對樣品污染程度的估計來確定。

堿處理
? 除乳與乳制品外，其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合15s。

分離培養(yǎng)
? 將乳與乳制品增菌液或經(jīng)過堿處理的其他食品增菌液分別接種于CIN-1瓊脂平板和改良Y瓊脂平板，26℃±1℃培養(yǎng)48h±2h 。
? 注意事項：在CIN-1瓊脂平板和改良Y瓊脂平板上劃線分離時，應(yīng)三區(qū)劃線，且線條稀疏不宜過密，以免雜菌生長過大，掩蓋可疑小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢出；

培養(yǎng)基原理解析

1、改良磷酸鹽緩沖液

? 山梨醇提供碳氮源，磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉為緩沖液，膽鹽抑制革蘭氏陽性菌，氯化鈉提供細胞所需要的滲透壓。

2、CIN-1瓊脂
? 胰胨和酵母浸膏提供氮源和微量元素；甘露醇為可發(fā)酵糖；去氧膽酸鈉和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌；中性紅是pH指示劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。。
? 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌落為深紅色中心，周圍具有無色透明圈（紅色牛眼狀菌落），菌落大小為1-2mm。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌落深紅色，周圍具有無色透明圈（紅色牛眼狀菌落）

3、改良Y瓊脂
? 蛋白胨和水解酪蛋白提供氮源和微量元素；乳糖用于糖發(fā)酵試驗；氯化鈉維持正常的滲透壓，去氧膽酸鈉和三號膽鹽抑制革蘭氏陽性菌；丙酮酸鈉刺激目標菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。
? 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌落為無色透明、不黏稠菌落。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌無色透明，不粘稠。

CRM017 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在顯色培養(yǎng)基上菌落特征
致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌→淡紫色	非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和（枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬、氣單胞菌屬等菌）→金屬藍色，在金屬藍色菌中生長被抑制或限制

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生化鑒定原理解析

1、改良克氏雙糖試驗

? 操作方法：分別挑取可疑菌落3個~5個，分別接種于改良克氏雙糖瓊脂，接種時先在斜面劃線，再于底層穿刺，26℃±1℃培養(yǎng)24h 。

? 改良克氏雙糖瓊脂：蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏提供氮源、維生素、礦物質(zhì)；山梨醇、葡萄糖提供可發(fā)酵糖類；硫代硫酸鈉可被某些細菌還原成H2S，與鐵離子生成黑色硫化鐵；酚紅是pH指示劑，發(fā)酵糖產(chǎn)酸變黃，產(chǎn)堿變紅；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在改良克氏雙糖瓊脂上的特征	大腸埃希氏菌在改良克氏雙糖瓊脂上的特征

? 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在改良克氏雙糖瓊脂上的特征斜面底層變黃不產(chǎn)氣。

? 注意事項：先在斜面劃線，再與底層穿刺。由于培養(yǎng)36~48h后小腸結(jié)腸炎耶爾森菌會產(chǎn)堿，造成斜面變紅，因此應(yīng)注意培養(yǎng)時效，在培養(yǎng)24h時觀察結(jié)果；

2、尿素酶實驗

? 操作方法：用接種環(huán)挑取一滿環(huán)可疑培養(yǎng)物，接種到尿素培養(yǎng)基，接種量要足夠大，26℃±1℃培養(yǎng)2h~4h，若陽性不明顯，則繼續(xù)培養(yǎng)到24h后再觀察。

? 尿素酶試驗原理：具有尿素酶的細菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)呈堿性，酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色，pH8.1呈粉紅色。

? 結(jié)果判讀：陽性為玫紅色；  陰性為淡橙紅色-淡黃色。

? 注意事項：接種量足夠大。

3、動力實驗

? 操作方法：將尿素酶試驗陽性菌落分別接種于兩管半固體培養(yǎng)基中，于26℃±1℃和36℃±1℃培養(yǎng)24h。

? 動力觀察原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、礦物質(zhì)；氯化鈉維持均衡的滲透壓；較少量的瓊脂作為培養(yǎng)基的凝固劑。

? 結(jié)果判讀：測試菌有動力的話，就會沿穿刺線擴散生長，無動力就不會擴散生長。

? 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌26℃±1℃溫度下有動力，擴散生長； 36℃±1℃溫度下沒動力，不擴散沿穿刺線生長；

4、革蘭氏染色鏡檢

? 操作方法：將在26℃有動力而36℃無動力的可疑菌培養(yǎng)物劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板,進行純化培養(yǎng)，用純化物進行革蘭氏染色鏡檢和生化試驗。

? 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌,有時呈橢圓或桿狀,大小為(0.8μm~3.0μm)×0.8μm

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與其他相似菌的生化鑒別表

其他相似菌生化鑒定

1、糖（醇）發(fā)酵試驗

? 絕大多數(shù)細菌都能利用糖（醇）類作為碳源和能源，但是它們在分解糖（醇）的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖（醇）并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來斷定。

? （指示劑為溴甲酚紫）結(jié)果判讀：陽性為變黃色；陰性為紫色。

2、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP試驗）

? 某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步將丙酮酸脫羧成為乙酰甲基甲醇，后面在堿性環(huán)境下被空氣中的氧氧化成為二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等所含的胍基結(jié)合，形成紅色的化合物，即VP試驗陽性。

? 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌VP陽性。

3、鳥氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

? 具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（鳥氨酸→腐胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯示出來。

? 結(jié)果判讀：陽性為試驗管為綠色-藍綠色，對照管變黃色；  陰性為試驗管和對照管均變黃色，或均不變色。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生化鑒定盒（GB 4789.8-2016）

? 生化反應(yīng)管：半固體瓊脂、尿素（凍干）、葡萄糖磷酸鹽胨水、鳥氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶對照、蔗糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖。

? 配套試劑：無菌液體石蠟，VP試劑（甲液：6% α-萘酚乙液：40%氫氧化鉀溶液），無菌水、生理鹽水，麥氏比濁管。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型鑒定（選做項目）

1、檢查培養(yǎng)物有無自凝性

? 使用接種在1.2%~1.5%固體瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物。在潔凈玻片上滴加一滴生理鹽水，將待測試培養(yǎng)物混合于生理鹽水滴內(nèi)，使之成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕搖動30~60s，黑色背景下觀察反應(yīng)，若出現(xiàn)可見菌體凝集，即可認為有自凝性，反之無自凝性。無自凝性的參照下面方法繼續(xù)鑒定。

2、血清型（O）鑒定

使用接種在1.2%~1.5%固體瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物，在玻片上劃出2個約1cm×2cm 的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴O因子血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜輕輕搖動混合30~60s，并對著黑色背景進行觀察，如O因子血清在2min內(nèi)出現(xiàn)比較明顯的小顆粒凝集者，且生理鹽水區(qū)無凝集現(xiàn)象，即為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌恒溫熒光核酸快速檢測法

全程最快僅需10h即可出檢測結(jié)果；最低檢測限為10-20CFU?。?/strong>

質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制

1、實驗室過程中，每批預(yù)增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

2、定期使用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CMCC(B)52204或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，污染劑量應(yīng)控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。

3、每2個月將所使用的培養(yǎng)基和生化試劑用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的標準菌株或陰性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）進行驗證，并進行記錄。

疑難解析

問：在前增菌或選擇性增菌結(jié)束后，肉湯未見微生物生長，是否可以終止實驗？
答：不可以，因為肉湯可見的細菌濃度為107CFU/ml，在此濃度一下，肉眼不能發(fā)現(xiàn)微生物生長，但實際溶液中有微生物生長。

問：為什么除乳制品外，其他食品前處理都要進行堿處理?
答：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌相對耐堿，堿處理降低雜菌干擾，提出檢出率；牛奶加減會使蛋白質(zhì)變性成團，增加檢出難度，故不需堿處理。 

問：為什么使用VITEK 2 Compact 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)不能準確鑒定出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌?
答：可以鑒定到屬，不能鑒定到種，還需結(jié)合其他生化進一步鑒定到種。

所需培養(yǎng)基試劑