高速振蕩樣品前處理器也叫脈沖均質器,屬于無菌均質器的一種,不同于拍擊式均質器,高速振蕩樣品前處理器采用一種變革性的新技術,通過高頻率震動內裝樣品的均質袋,產(chǎn)生強烈沖擊波與高速攪動聯(lián)合作用,使樣品得到均質。在微生物檢測樣本制備中,樣品中表面與較深層的微生物會充分而迅速地驅趕到樣品懸液,形成菌濃度均勻的樣品稀釋液。這個是食品微生物定量檢測中均質前處理的關鍵步驟。
在食品微生物檢測中最多的是檢測細菌總數(shù),以高速振蕩均質器為例,有以下幾大步驟:
1、 樣品的稀釋
1.1 用開口器打開均質袋后一起放上電子天平,按“去皮鍵”,然后直接稱取 25 g 樣品(固體/半固體/液體樣品),再加入225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。
控制面板可以用來自定義操作程序,可以保存20個程序,其中程序01(肥肉:1分鐘); 程序02(粉狀物:15 秒);程序03(膏狀物:1分鐘);程序01,程序02,程序03是預先設置好的,不可以更改,其余每個程序可以通過控制面板進行更改或更新。
根據(jù)樣品選擇均質時間(一般30秒至2分鐘),制成 1:10 的樣品勻液。
1.2 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL,沿管壁緩慢注于盛有 9 mL 稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用 1 支無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成 1:100 的樣品勻液。
1.3 按.1.2 操作程序,制備 10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用 1 次 1 mL無菌吸管或吸頭。
1.4 根據(jù)對樣品污染狀況的估計,選擇 2 個~3 個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液), 在進行 10 倍遞增稀釋時,吸取 1 mL 樣品勻液于無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿。同時,分別吸取 1 mL 空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。
1.5 及時將 15 mL~20 mL 冷卻至 46 ℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于 46 ±1 ℃全不銹鋼恒溫水浴鍋WBK-4中保溫)傾注平皿,并轉動平皿使其混合均勻。
2 樣品培養(yǎng)
2.1 待瓊脂凝固后,將平板翻轉,36 ±1 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱HKP-9172A中培養(yǎng)48 h±2 h。水產(chǎn)品 30 ±1 ℃培養(yǎng) 72 h±3 h。
2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時,可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層 瓊脂培養(yǎng)基(約 4 mL),凝固后翻轉平板,按 2.1 條件進行培養(yǎng)。
3 菌落計數(shù)
可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落 形成單位(colony-forming units,CFU)表示。
3.1 選取菌落數(shù)在 30 CFU~300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于 30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù),大于 300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。
3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘以 2,代表一個平板菌落數(shù)。
3.3 當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。
4 結果與報告
4.1 菌落總數(shù)的計算方法
4.1.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內,計算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù),作為每 g(mL)樣品中菌落總數(shù)結果。
4.1.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內時,按公式(1)計算:
4.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300 CFU,則對稀釋度高的平板進行計數(shù),其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數(shù)乘以高稀釋倍數(shù)計算。
4.1.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30 CFU,則應按稀釋度低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
4.1.5 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于 1 乘以低稀釋倍數(shù)計算。
4.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU~300 CFU之間,其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU 時,則以接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
4.2 菌落總數(shù)的報告
4.2.1 菌落數(shù)小于 100 CFU 時,按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報告。
4.2.2 菌落數(shù)大于或等于 100 CFU 時,第 3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前 2 位數(shù)字,后面用 0 代替位數(shù);也可用 10 的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。
4.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù),則報告菌落蔓延。
4.2.4 若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。
4.2.5 稱重取樣以 CFU/g 為單位報告,體積取樣以 CFU/mL 為單位報告。