單核細胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性

生物學(xué)特性：單核細胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌，營養(yǎng)需求不高，兼性厭氧。該菌觸酶陽性，有動力，具有溶血反應(yīng)、能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖和七葉苷，不能發(fā)酵甘露醇和木糖，MR-VP陽性。

流行學(xué)特征：單核細胞增生李斯特菌是一種人畜共患病原菌，它的臨床癥狀為菌血癥、腦膜炎及導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)。單核細胞增生李斯特菌廣泛分布存在于自然界，可以加熱殺死，但是對高濃度鹽和酸相對不敏感。它還能在冰箱溫度和真空包裝內(nèi)增殖，特別有風(fēng)險的材料包括生或加工肉類、生牛奶產(chǎn)品、生或熏魚、預(yù)制沙拉和長期真空儲存的包裝食物。

單核細胞增生李斯特氏菌的國標(biāo)檢驗方法

操作注意事項

1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類）進行檢測時，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：預(yù)增菌時間與樣品種類、目標(biāo)菌和雜菌的含量及狀態(tài)等因素有關(guān)。一般菌相比較復(fù)雜的高污染樣品，如果增菌時間過長會導(dǎo)致雜菌生長過多，目標(biāo)菌可能就會被另一種優(yōu)勢菌所取代，這種情況下，增菌時間不宜過長。低污染樣品的增菌時間可以適當(dāng)延長。由于本標(biāo)準(zhǔn)適用的樣品種類眾多，預(yù)增菌的時間應(yīng)根據(jù)實際情況和經(jīng)驗進行具體選擇。建議增菌液發(fā)生混濁時停止預(yù)增菌。
3：分離劃線用直徑3mm的接種環(huán)（1環(huán)約10微升）。
4：動力試驗的培養(yǎng)溫度不能超過30℃。

操作難點1-可疑菌落的識別

1）PALCAM培養(yǎng)基

可疑菌落特征：在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。

疑點：單核細胞增生李斯特氏菌與屬內(nèi)其他李斯特氏菌菌落特征無明顯差別，可疑菌落多，后續(xù)確證工作量大。

2）CRM014 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基

可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規(guī)測光滑的小菌落，周圍有乳白色脂肪沉淀環(huán)；其他李斯特氏菌為藍綠色無暈圈菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。

疑點：乳白色脂肪沉淀環(huán)擴散覆蓋其他菌落時極易引起假陽性。

操作難點一的解決方案：

1）CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基

可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規(guī)測光滑的小菌落；其他李斯特氏菌為無色菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。

李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基與單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的對比

CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢

配制簡便：添加劑易溶，克服李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基配制不當(dāng)所致暈圈特征不明顯問題，同時節(jié)省了時間和減少了勞動強度。
特異性極強：對于陰性菌有著很好的抑制作用；對于有害李斯特菌和無害李斯特菌，有著很好的分辨能力和靈敏度；
結(jié)果易讀：顏色清晰易辯，結(jié)果一目了然；
準(zhǔn)確率高：能避免假陽性及假陰性結(jié)果。

操作難點二：可疑菌落鑒定

1）革蘭氏染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌。

2）動力試驗：李斯特氏菌有動力,在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長,如傘狀生長不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng)5再觀察結(jié)果

3）過氧化氫酶試驗：李斯特氏菌過氧化氫酶陽性反應(yīng)

4）傳統(tǒng)生化試驗：七葉苷、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖磷酸鹽胨水（MR/VP）

5）溶血試驗：單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈；斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈；英諾克李斯特氏菌無溶血圈；伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h~48h再觀察。

注意事項：穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24h~48h，于明亮處觀察。

6）協(xié)同溶血試驗cAMP（可選做項目）

實驗操作：在血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，距離1~2mm，于36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。

結(jié)果判讀：單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm 的β-溶血增強區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm~10mm 的“箭頭狀”β-溶血增強區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯，可置4 ℃冰箱24h~48h再觀察。

操作難點二解決方案：

1）MID67李斯特氏菌鑒定系統(tǒng)

MID67 李斯特菌鑒定系統(tǒng)優(yōu)點

MID67 中的溶血試驗反應(yīng)，可替代傳統(tǒng)的血平板溶血試驗和CAMP

MID67  李斯特菌鑒定系統(tǒng)使用流程

最后將數(shù)值編碼輸入MID數(shù)據(jù)庫中檢索，即可獲得鑒定結(jié)果。

2）單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR快檢法

產(chǎn)品：單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR擴增試劑盒

技術(shù)原理：基于實時熒光PCR技術(shù)，針對檢測目標(biāo)特異性基因片段設(shè)計引物和熒光探針并優(yōu)化反應(yīng)所需試劑組分，加入待檢樣品核酸即可進行擴增反應(yīng)。在擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應(yīng)的實時擴增曲線，進而判定目標(biāo)基因是否檢出。

產(chǎn)品優(yōu)勢：快速提取，一步法核酸提取，快速高效，核酸提取效率高；  操作簡單，提供PCR反應(yīng)體系預(yù)混液，直接加樣檢測，無需自行配制；  特異性強，采用高特異性引物及探針，確保實驗準(zhǔn)確性；  靈敏度高，采用高效的擴增酶，檢測靈敏度可達10-100copies/test。

產(chǎn)品組成：

質(zhì)量控制及疑難解析

一，質(zhì)量控制

1： 實驗室過程中，每批預(yù)增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。
2： 定期使用單核細胞增生李斯特氏菌ATCC19115菌種或等效的其他標(biāo)準(zhǔn)株，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M行陽性對照實驗驗證，污染劑量應(yīng)控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。
3：要求對使用的培養(yǎng)基和生化試劑每批均用GB4789.30-2016推薦的陽性和陰性對照標(biāo)準(zhǔn)菌種進行驗證，并做好記錄。

二，疑難解析

Q1： 為什么在沒有典型菌落時仍要挑取非典型菌落進行鑒定？
根據(jù)經(jīng)驗，有少數(shù)單核細胞增生李斯特氏菌在李斯特顯色平板上呈現(xiàn)非典型菌落。
Q2：為什么在PALCAM選擇性平板上挑取典型菌落，鑒定后非單核細胞增生李斯特菌的概率較高？
PALCAM是李斯特菌屬的選擇性平板，根據(jù)經(jīng)驗，環(huán)境存在較多的英諾克李斯特菌，應(yīng)結(jié)合顯色平板，挑取較多的典型菌落鑒定。
Q3：當(dāng)3個及以上連續(xù)稀釋度的結(jié)果均為陽性時，如何選擇？
選擇原則參考Bacteriological Analytical Mannual Appendix 2: Most Probable Number form Serial Dilutions。
Q4：如果前增菌或選擇性增菌結(jié)束后，肉湯中未見微生物生長，是否可以終止實驗？

不可以，因為肉眼可見的細菌濃度為107CFU/mL，在此濃度以下，肉眼是不能發(fā)現(xiàn)。

所需培養(yǎng)基試劑